apotik online terpercaya

metode ekstraksi terbaik untuk mengidentifikasi DNA dari sampel tulang- Kimia Forensik

| July 19, 2012 | 1 Comment
  1. I. Latar Belakang

Kematian massal adalah kematian sejumlah besar orang dikarenakan satu kejadian. Kematian massal dapat disebabkan beberapa hal, seperti bencana alam, kecelakaan transportasi massal, konflik bersenjata, terorisme dan lain sebagainya. Angka kematiannya tergolong tinggi. Berdasarkan data PBB, Indonesia menempati posisi kedua, di bawah Banglades. PBB mendata sedikitnya terdapat 191.164 jiwa yang tewas akibat bencana alam di Indonesia selama 1980-2009. Di Bangladesh, bencana alam dalam 20 tahun merenggut nyawa 191.650 jiwa. Selain itu, PBB juga merinci daftar negara di Asia Pasifik yang mengalami bencana alam selama periode 1980-2009. Bencana alam itu baik berupa, banjir, kekeringan, letusan gunung berapi, tanah longsor, dan lain-lain. Indonesia menempati posisi keempat dalam jumlah kasus bencana alam di Asia-Pasifik. Selama 1980-2009, negeri ini mengalami 312 kasus. Peringkat pertama dihuni China (574 kasus), kemudian disusul India (416), Filipina (349), dan Indonesia (VIVAnews.com). Jumlah tersebut belum ditambah dengan tingginya kejadian kecelakaan pesawat, kapal laut dan terorisme yang juga berpotensial menyebabkan kematian massal.

Jenazah korban yang meninggal karena kematian massal seringkali ditemukan dalam kondisi yang sudah rusak, tidak utuh atau tinggal tulang belulang saja. Hal ini dikarenakan terjadi degradasi atau kerusakan jaringan pada jenazah. Kerusakan jaringan tersebut dapat dikarenakan terbakar, lama terkubur, terlalu lama tidak dievakuasi sehingga membusuk dan terdegradasi, sehingga sulit untuk dijadikan bahan sumber identifikasi. Tulang tidak mengalami pembusukan, sehingga dapat digunakan sebagai sumber DNA untuk identifikasi.

Identifikasi manusia melalui DNA memerlukan metode-metode tertentu, diantaranya adalah metode PCR dan STR. Untuk mengidentifikasi DNA dengan metode PCR dan STR, diperlukan marker DNA. Untuk mendapatkan DNA dari sampel tulang, diperlukan metode khusus, karena kemungkinan kondisi tulang telah rusak, kotor, dan terkena pengaruh lingkungan. Selain itu, adanya barrier fisik dan kimia dari tulang yang melindungi DNA menyebabkan reagen sulit menarik DNA. Karena itu, optimasi metode ekstraksi untuk mendapatkan DNA dari sampel tulang perlu dilakukan untuk memaksimalkan dan memudahkan analisis DNA melalui sampel tulang.

Ada 2 metode yang biasa digunakan untuk ekstraksi DNA, yaitu metode ekstraksi organik fenol/kloroform dan metode pengikatan dengan silika. Prinsip kerja dari metode ekstraksi DNA dengan silika adalah menyerap DNA dengan menggunakan silika dan garam chaotropik. Garam chaotropik berfungsi untuk merusak jaringan ikatan hydrogen dalam air sehingga membuat protein-protein yang merupakan kotoran-kotoran pada DNA denaturasi atau lisis dan asam nukleat yang lebih stabil secara termodinamika daripada struktur sebenarnya. Pada larutan pH asam ( + < 7,5 ), DNA diserap oleh silica. Sedangkan pada larutan pH basa dan konsentrasi garam rendah, DNA akan secara efisien dipisahkan dari silika. Sedangkan Prinsip kerja dari metode ekstraksi DNA dengan pelarut organik adalah pelarut organik akan mengikat, menarik, dan mempresipitasi protein sehingga fase air yang terpisah akan mengandung DNA. Larutan disentrifuse untuk mengendapkan protein sehingga air yang mengandung DNA (di lapisan atas) dapat diambil dan dianalisa. Pada makalah ini dibandingkan secara kuantitatif analisis DNA melalui PCR dan STR dengan metode ekstraksi organik  fenol/kloroform dan metode pengikatan dengan silika.

 

  1. II. Rumusan Masalah

Apakah metode ekstraksi terbaik untuk mengidentifikasi DNA dari sampel tulang ?

 

  1. III. Tujuan

Mengetahui metode ekstraksi terbaik untuk mengidentifikasi DNA dari sampel tulang.

 

  1. IV. Material dan Metode

Pengaturan Laboratorium

Laboratorium untuk uji STR dengan sampel tulang dibagi menjadi 6 area untuk pembersihan fisika, pembersihan kimiawi, grinding, ekstraksi DNA, pengaturan PCR dan amplifikasi DNA atau analisis fragmen. Semua aktivitas dilakukan dalam ruangan berlapis Plexiglas, kecuali untuk sequencer loading. Seluruh area dibersihkan tiap hari dengan 0,5% Natrium Hipoklorit dan alat yang digunakan tidak dicampur dengan alat dari area yang berbeda. Semua staf menggunakan jas laboratorium, masker, tudung kepala, sarung tangan dari nitril, dan jas laboratorium yang berbeda tiap ruangan. Semua staf secara rutin membersihkan sarung tangannya untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Semua alat dan bahan yang digunakan bebas DNA dan di radiasi dengan sinar UV (> 1.0 J/cm) selama minimal 25 menit.

Sampel Tulang

20 tulang femur dipilih secara acak. Sampel tersebut diharapkan jumlahnya cukup banyak untuk mendeteksi tren kedua metode yang digunakan dan representatif dalam mewakili sejumlah sampel yang telah disimpan. Femur diperoleh dari korban pembunuhan di Balkan selama konflik bersenjata pada tahun 1992 hingga 1995. Berat awal dari sampel berkisar antara 12 hingga 22 gram. Sampel diperoleh dari pemakamam massal.

4.1 Pembersihan Sampel Tulang

Material di permukaan tulang seperti sum-sum tulang, jaringan yang melekat pada tulang, dan partikel lain dibersihkan dari tulang dengan rotary sanding tool (Dremel, Racine, WI, USA). Kemudian, 2-3 mm bagian permukaan tulang dikikis untuk menghilangkan kontaminan. Tulang yang tersisa ditempatkan pada tube berukuran 50 ml dan dibersihkan lebih lanjut dengan 30 ml aquades selama 30 detik, lalu dicuci dengan 10% pemutih komersial (0,5% natrium hipoklorit) selama 30 detik dan terakhir dengan 96% etanol selama 30 detik. Setelah dibersihkan dengan metode kimiawi lalu tulang dikeringkan pada suhu 50 °C selama 2 jam.

 

4.2 Grinding Tulang

Tulang yang diserbuk menjadi serbuk yang sangat halus (fine powder) menggunakan blender apparatus (Waring, Torrington, CT, USA) steril. Serbuk tulang dibagi dua sama banyak lalu dimasukkan ke dalam 2 tube berukuran 50 ml, yang masing-masing tube dapat berisi sampel berkisar antara 5,6 – 9,8 gram.

4.3 Silica-based DNA Extraction

Prosedur ini berpedoman pada Qiagen’s Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Germany), dengan beberapa modifikasi substansial. Serbuk tulang diinkubasi pada 15 ml buffer ATL dengan 10 mg proteinase K (20 Unit/µg) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) dan 300 µL 1 M DTT (Invitrogen) dan diinkubasi pada suhu 56 °C selama 18 jam dalam shaking water bath. Digesti selanjutnya dilakukan dengan penambahan 14 mL buffer AL (Qiagen) dan didiamkan selama 30 detik dan diinkubasi pada suhu 70 °C selama 1 jam dalam shaking water bath. Tulang yang tersisa disentrifugasi (Eppendorf, Hamburgs, Germany) pada ~ 1000×g selama 5 menit dan supernatant dipindahkan ke dalam tube berukuran 50 mL lainnya. 22 mL etanol 96% ditambahkan kedalam sampel dan dicampurkan dengan inverse selama 15 detik. DNA terikat pada kolom Qiagen Blood Maxi dengan penambahan 15 ml hasil ekstraksi yang telah dicampur sebanyak 3 kali, disentrifugasi pada 2000×g selama 3 menit pada swinging bucket rotor dan me-reject yang mengalir. Kolom yang telah mengikat DNA dicuci dengan 10 mL buffer AW1 (Qiagen), disentrifugasi pada 2000×g selama 3 menit dan me-reject yang mengalir. Pencucian yang kedua dengan penambahan 10 mL buffer AW2 (Qiagen), disentrifugasi pada 2000×g selama 3 menit dan me-reject yang mengalir. Bufer AW2 yang tersisa  dipindahkan dengan cara sentrifugasi pada 2000×g selama 10 menit. DNA dieluasi dengan penambahan 3 mL buffer AE (Qiagen) yang sebelumnya telah dipanaskan hingga mencapai suhu 72 °C lalu disentrifugasi pada 2000×g selama 3 menit. Eluasi kedua dilakukan dengan metode yang sama. 6 mL DNA hasil eluasi dipekatkan hingga ± 0,5 mL dengan penambahan 15 mL kolom Centriplus YM-100 (Millipore, Billerica, MA, USA) dan disentrifugasi pada 2000×g selama 3 menit dengan swinging bucket rotor. Konsentrat 0,5 mL dipindahkan dan ditambahkan pada kolom Centricon YM-100 (Millipore), dan diputar selama 15 menit pada sudut rotor 38 ° hingga diperoleh konsentrat 50 µL. Konsentrat dicuci 2 kali dengan penambahan 2 mL air (ultra murni) lalu disentrifugasi selama 15 menit pada sudut rotor 38 ° hingga diperoleh konsentrat 50 µL. Konsentrat kemudian dipindahkan pada tube berukuran 1,5 mL. Membran Centricon dicuci dengan 100 µL air dan air tersebut kemudian ditambahkan pada tube 1,5 ml yang berisi konsentrat DNA. DNA sebanyak 150 µL kemudian dipekatkan menjadi ± 100 µL dengan vacuum concentrator (Eppendorf).

4.4 Organic Based DNA Extraction

Serbuk tulang diinkubasi dengan pengadukan pada suhu 55 °C selama 18-24 jam dalam buffer ekstraksi organik (50 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, 50 mM asam etilendiamin tetraasetat [EDTA], 0,5% SDS, pH=8), dan 20 mg proteinase K (20 Unit/µg) (Invitrogen). Setelah inkubasi, tambahkan 20 mL fenol/kloroform/isoamilalkohol (25:24:1) (Invitrogen), tube dikocok selama 30 detik, dan diputar (spun) selama 20 menit pada 2000 x g. Supernatan dipindahkan ke wadah lain yang berisi 20 mL kloroform/isoamilalkohol (24:1), dikocok selama 30 detik, dan diputar (spun) selama 20 menit pada 2000 x g. Ekstraksi dengan kloroform/isoamilalkohol diulang lagi dengan cara yang sama. Larutan yang mengandung DNA dipekatkan hingga 0,5 mL menggunakan konsentrator Centriplus YM 100.  Konsentrat dipindahkan dari kolom Centriplus, dan dimasukkan ke dalam kolom Centricon YM-100, dan diputar selama 15 menit pada sudut rotor 38 ° hingga diperoleh konsentrat 50 µL. Konsentrat tersebut kemudian di cuci dua kali dengan penambahan 2 mL air (ultra pure), lalu disentrifugasi selama 15 menit pada sudut rotor 38 ° hingga diperoleh konsentrat 50 µL. Kemudian konsentrat dipindah ke tube 1,5 mL. Membran Centricon dicuci dengan 100 µL air lalu dimasukkan ke dalam tube 1,5 mL bersama konsentrat DNA. 150 µL DNA lalu dipekatkan hingga 100 µL dalam vacuum concentrator (Eppendorf).

 

 

4.5 Amplifikasi dan Analisis Fragmen

10 µL ekstrak yang diperoleh dari masing-masing metode diamplifikasi. Amplifikasi dilakukan pada Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA, USA) 9700 thermocycler menggunakan Promega (Madison, WI, USA) PowerPlex 16 (PP16) kit. Kondisi amplifikasi yang direkomendasikan diikuti, dengan hanya satu modifikasi. Waktu untuk ekstensi pada suhu 72°C digandakan dari 30 detik menjadi 1 menit untuk 10 siklus pertama, dan dari 45 detik menjadi 90 detik untuk 22 siklus berikutnya. Fragmen STR yang di amplifikasi di analisis pada ABI 3100 DNA sequencer menggunakan prosedur pada manual yang disediakan Promega. Data dianalisis menggunakan software ABI GeneScan and Genotyper (versi 3.7). PowerTyper Macro V.2 (biosistem yang diaplikasikan) digunakan untuk genotype sampel. Lokus yang dilaporkan adalah hasil dari duplikasi amplifikasi yang tidak menimbulkan keraguan.

4.6 Kuantifikasi DNA dan Assesmen inhibitor PCR dalam Ekstrak

Semua ekstrak DNA yang dikuantifikasi diduplikasi, dengan real-time DNA, menggunakan sistem Applied Biosystems total Human Qualifier dan system Applied Biosystems 7700 Sequence Detection. Sistem kuantifikasi ini melibatkan reaksi duplex PCR dengan dua set independen dari PCR primer dan probe TaqMan. Satu set primer dan 6-FAM-labeled TaqMan probe spesifik untuk DNA manusia, sedagkan set primer lainnya dan target VIC-labeled TaqMan probe yang merupakan sekuen sintetik yang diutamakan dalam setiap reaksi amplifikasi sebagai kontrol positif. Sinyal 6-FAM dimonitoring dengan system deteksi sequence ABI dan kuantifikasi dapat dikalkulasi berdasarkan sinyal amplifikasi. Plot amplifikasi dari probe VIC-labeled digunakan untuk determinasi bila inhibitor PCR telah ada pada ekstrak DNA. Inhibitor PCR mempengaruhi awal kerja amplifikasi eksponensial, dan oleh karena itu dapat dideteksi dengan menggunakan peningkatan nilai Ct untuk kontrol positif (yang seharusnya masih dalam nilai konstan bila tidak terdapat inhibitor PCR).

 

 

  1. V. Pembahasan

Metode ekstraksi DNA menggunakan silika yang telah dilakukan terbukti sangat efektif dalam menyediakan profil PP16 STR dari tulang dan gigi dari jasad yang berumur 3-15 tahun dan yang telah terpapar oleh berbagai kondisi lingkungan yang merusak. Seringkali telah kontak dengan tanah dan bahan lain dalam kuburan masal yang mendekomposisi tubuh. Bahkan, jika metode ini digabungkan dengan STR typing, akan memberikan tingkat keberhasilan 95,4% dari 1823 sampel tulang atau gigi dari tsunami asia pada tahun 2004 yang diidentifikasi oleh ICMP. Tingkat keberhasilan metode ini cukup tinggi daripada penelitian awal di Yugoslavia yang diekstraksi menggunakan metode organik standar oleh ICMP. Atau diluar laboratorium. Penelitian kali ini dilakukan pada sampel tulang yang sama menggunakan kedua metode tersebut untuk menverifikasi dan mengembangkan perbandingan analisis. Metode silika menghasilkan jumlah DNA yang lebih tinggi dengan tingkat hambatan yang lebih rendah daripada metode organik.

 

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tulang paha yang memiliki kandungan DNA tertinggi dibandingkan semua bagian tulang lainnya, kecuali gigi. DNA dalam kuantitas besar telah berhasil diisolasi dengan metode ekstraksi silika, disarankan menggunakan buffer pencerna atau penghancur ATL dan AL yang lebih efisien daripada buffer ekstraksi organik Tris/NaCl/sds/50mM EDTA dalam melepaskan DNA dari sampel tulang. EDTA juga  tersedia dalam bentuk buffer Qiagen, meskipun konsentrasinya tidak diketahui secara umum. Buffer telah ditetapkan bahwa demineralisasi penuh serbuk tulang dengan menggunakan DNA konsentrasi tinggi memberikan efek yang sangat bermanfaat dalam perolehan kembali DNA. Keberadaan jumlah serbuk tulang setelah diekstraksi menggunakan silika oleh ICMP menunjukkan bahwa demineralisasi tidak lengkap. Alasan lain yang mungkin untuk hasil akhir DNA yang besar didapat karena membran silika Qiagen lebih efektif dalam merekoveri DNA daripada proses pemisahan menggunakan teknik ekstraksi organik.

Sistem kuantifikasi Real-time PCR. Quantifiler yang dipilih untuk menentukan jumlah DNA yang terekstraksi dari sampel tulang karena metode ini juga akurat untuk rentang konsentrasi DNA yang komponen penghambat PCR di dalam ekstrak DNA. Teknik ekstraksi DNA menggunakan silika menunjukkan isolat rata-rata lebih banyak daripada metode ekstraksi organik. Sampel yang diekstraksi oleh ICMP dengan metode ekstraksi silika menghasilkan 23 pg/µl atau lebih, ketika hanya 45% dari sampel terekstraksi dengan metode organik. Ekstraksi organik juga menunjukkan tingkat hambatan yang tinggi, dengan 65% dari ekstrak menunjukkkan peningkatan 1 cycle atau lebih pada harga Ct Quantifiler untuk kontrol positif internal.

 

Perlu diketahui bahwa ketika jumlah DNA yang diinput kedalam reaksi PCR kurang dari 250 pg, hasilnya dapat menunjukkan efek stokastik, seperti ketidakseimbangan puncak dan allele dropout. Sampel pada penelitian ini memiliki lebih dari 150 pg DNA untuk direaksikan ke dalam PCR sehingga dapat meng-amplifikasi keenam belas lokus STR; termasuk semua sampel yang diekstraksi menggunakan metode ekstraksi silika. Disisi lain, 10 ekstrak DNA yang diperoleh melalui metode ekstraksi dengan pelarut organik menghasilkan konsentrasi DNA 60-150 pg, yang nantinya akan diujikan ke dalam reaksi PCR dengan volum 10 µl, 4 dari ekstrak tersebut berhasil meng-amplifikasi 16 lokus STR, 4 lainnya dapat berhasil meng-amplifikasi 13 lokus STR, dan 2 sampel lainnya tidak menghasilkan profil lokus yang sempurna (partial). Sampel 9100990 dan 9102658 yang diekstraksi dengan metode pelarut organic tidak menghasilkan profil yang sempurna, namun karena kedua sampel tersebut mengalami inhibisi  (dengan peningkatan Crs oleh pada 3 dan 5 siklus, bila dibandingkan dengan metode silika), maka tidak dapat diketahui penyebabnya. Penyebab diperolehnya profil lokus yang tidak sempurna dapt disebabkan oleh kadar DNA rendah, adanya inhibitor atau hambatan pada proses amplifikasi ataupun kedua faktor tersebut.

Sehingga dapat disimpulkan bahwa sulit untuk memprediksi urutan DNA atau karakteristik tulang. Sesuai dengan pernyataan ini sampel yang menghasilkan jumlah DNA yang rendah atau profil parsial tidak dapat menunjukkan karakteristik yang sesuai sehingga menyebabkan terjadinya spekulasi mengapa metode tersebut gagal atau mengapa terjadi variasi hasil yang berbeda antara kedua metode tersebut. Metode ekstraksi dengan silika dapat memberikan nilai rekoveri yang tinggi sehingga dapat diperoleh profil DNA yang sempurna, kemampuan untuk memperoleh profil nuclear STR dari tulang yang mengalami degradasi dapat diaplikasikan untuk identifikasi forensik dalam bencana masal, serangan teroris, maupun kuburan masal. Penting untuk membandingkan dan mendokumentasikan karakteristik dan efikasi dari berbagai metode ekstraksi DNA dengan tujuan menghasilkan landasan untuk menyeleksi teknik yang paling tepat dan untuk menentukan kemampuan dan keterbatasan  dari metode yang digunakan. Metode ekstraksi DNA dengan silika yang dikembangkan oleh ICMP menunjukkan tingkat keberhasilan yang tinggi pada berbagai sampel. Metode ini menghasilkan rangkaian DNA yang sempurna, tidak memberikan hambatan pada proses amplifikasi, dan menghasilkan profil STR  yang lebih baik dibandingkan dengan metode standar ekstraksi DNA dengan pelarut organik.

  1. VI. Kesimpulan

Metode ekstraksi DNA menggunakan silika menunjukkan tingkat keberhasilan yang tinggi pada berbagai sampel. Metode silika menghasilkan kuantitas DNA yang lebih besar, hambatan amplifikasi yang lebih rendah dan tingkat keberhasilan yang lebih tinggi dalm memperoleh profil STR dibandingkan metode ekstraksi standar dengan pelarut organik.


Daftar Pustaka

Devore, J., Vanek, D., Konjhodzic, R., Crew, J., Huffine, E., Parsons, T, J., 2007, Highly effective DNA extraction method for nuclear short tandem repeat testing of skeletal remains from mass graves, Croat Med J,  Vol. 48, p 475-85

Anonim, 2011a. PCR. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Diakses tanggal 3 Mei 2011.

Anonim, 2011b. Short Tandem Repeats (STRs). http://www.forensicdnacenter.com/. Diakses tanggal 3 Mei 2011.

 

 

Category: Farmasi

Comments (1)

Trackback URL | Comments RSS Feed

  1. fake rolex says:

    Hello There. I found your blog using msn. This is a really well written article. I?l make sure to bookmark it and return to read more of your useful information. Thanks for the post. I?l definitely return.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *